前沿综述：人工细胞的过去、现在、未来

译者按

“我们能人工合成一个细胞吗？Can a cell be artificially synthesized ?”——这是2021年《科学》期刊新发布的世界最前沿的125个重大科学问题之一。

“生命如何起源？非生命的无机物质如何能通过复杂系统涌现为有机生命体？人类有没有能力从头创造生命？我们是否能掌控细胞这样的复杂系统？”——笔者相信，这是大量科研同行和热心读者所感兴趣的问题。

近年来，随着分子生物学和结构生物学的发展，我们对细胞复杂系统的组成、结构、功能和特征等认识已有了巨大飞跃。当科学家“庖丁解牛”般把细胞拆成五花八门的“零件”时，手握各种生命基本组件的他们，又将如何按照自己对细胞和生命复杂系统的理解，重组出一个人工细胞？

“生与死的界限是什么？”当我们试图用毫无生机的化学分子组装出一个生机勃勃的人工细胞之时，“生命是什么”的生物学哲学问题会将我们困住吗？这是一次化学家和合成生物学家携手发起的向死而生的挑战：

（1）Plan A：自下而上策略，死→生

——化学家从“死的此岸”出发，从分子开始组装，逐步积累系统复杂度，用自组装突破死与生的界面。

（2）Plan B：自上而下策略，生→死

——合成生物学家则从“生的彼岸”启程，从活细胞开始删减要素，逐步剔除系统复杂度，用基因编辑勾勒出生命的极限。

或许突然有一天，他们会在旅途中顺利会师，披荆斩棘，开辟大道。

这是一段“从零开始的生命创造”之旅，我们已通过劳动创造出了各式各样的机器设备（电脑、飞机、火箭），以及繁荣的社会和文明。笔者相信，我们在未来也一定可以自由地创造生命复杂系统。那么，构建人工细胞的研究将会是未来人类创造生命之旅中的第一座险峰。

若能感受到人类凭借自己的智慧和力量从头创造出一个真正细胞之困难，或许能让我们更加科学地理解到自己生命的复杂系统的宝贵、来之不易，以及“拥有全身上下的无数细胞为我们辛勤工作”是一件多么幸福的事情。

此次翻译的综述，介绍了人工细胞领域的“昨天今天明天”。虽然我们离真正地创造一个细胞还很遥远，但在旅途之中，人工细胞研究或许会催生出广泛的应用，甚至成为“下一个风口”“下一代生物智能材料”也说不定哦。毕竟，“造物致知，造物致用”，“与其期待未来，不如自己创造”。

关键词：人工细胞，生命起源，生命复杂系统

Wentao Jiang, Ziyu Wu, Zheng Gao, Mimi Wan, Min Zhou等 | 作者

余凡尘 | 译者

邓一雪 | 编辑

论文题目：

Artificial Cells: Past, Present and Future

论文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsnano.2c06104?ref=PDF

目录

摘要

一、人工细胞的发展历程

二、人工细胞的研究现状

三、人工细胞的前景

摘要

构建人工细胞是为了仿造天然细胞，以便研究者们探索生物过程和生命起源。对于人工细胞的构建方法，无论是自上而下还是自下而上的方法，在过去几十年中都取得了长足进步。本文中，我们全面概述了人工细胞的发展及其特性和应用。在材料方面，人工细胞可衍生于脂质、聚合物、脂质/聚合物混合物、天然细胞膜、胶体囊泡（colloidosome）、金属-有机框架材料和凝聚体（coacervates）。在策略方面，可通过将蛋白质和基因嵌入人工细胞表面或封装在人工细胞内部，而赋予其各种功能。这些调制方法塑造了人工细胞的特性，包括能量生产、细胞生长、形态变化、细胞分裂、跨膜转运、环境响应、运动性和趋化性。

本文讨论了这些人工细胞的多种应用，重点是医疗应用。其中，人工细胞可用作材料和信息交换的载体，并已被证明可作为个性化药物的靶向递送系统。此外，人工细胞还能替代功能受损的天然细胞，基于人工细胞的酶疗法和免疫疗法已成为研究热点。最后，讨论了细胞仿生的特性和广泛应用的发展前景。

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细胞是生命的结构基础和功能单位。它是具有独立复制能力的最小生命单元。[1]自从1839年施莱登（Schleiden）和施旺（Schwann）正式提出细胞学说以来，细胞生物学研究已扩展至诸多领域，如生命起源、细胞工程、生物传感器、载药技术和医学等。[2]细胞由于内在的复杂性和脆弱性，在体外很容易失活或死亡，[3]所以探索细胞的复杂生物学过程和生命起源极具挑战性。为了克服这些问题，研究人员构建了多种仿生天然细胞的人工细胞。[4,5]这些人工细胞已被用作仿生系统，以研究和理解天然细胞的特性，或将应用于替代活细胞。

1957年，Chang提出了人工细胞（artificial cell）的概念，他成功地用细胞膜成分中的脂质创造出囊泡。[6]一个人工细胞就是一个密闭容器，其中封装了酶和基因这类可帮助容器呈现仿生行为的生物活性物质（图1）。[7]自从Chang提出以来，“人工细胞”和“合成细胞”（synthetic cell）这两个词常被混用，且未有一个准确的科学定义。Tian等人将人工细胞描述为区室化的微结构，它们是一种包含任何可能发生的生化反应或生物活动的仿生模型。[8]Jeong等人指出，“人工细胞”相比更简单的人工结构，诸如脂质体（原始细胞）或功能有限的脂质体（合成细胞），可表现出特定且差异化的特征。该作者将“人工细胞”定义为具有以下仿生功能的类细胞结构：（1）与活细胞的细胞组件（磷脂、能量转换蛋白和离子通道等）组装在一起，（2）以一种自生成的规则来产生能量（3）并将产生的能量用于自身代谢活动。[9]

图1. 人工细胞的产生、现有特性和应用，以及未来潜在的方向。图片是在 Figdraw [ www.figdraw.com]的帮助下制作的。

值得注意的是，人工细胞不同于细胞工程的产物。人工细胞是指由研究人员使用天然材料或合成材料来设计和制备的类似于生物细胞的结构。人工细胞被设计出来，旨在表现出与活细胞的生物学过程相似的功能，包括细胞代谢、细胞通讯和生物催化降解。相比之下，细胞工程是通过物理和化学方法改造现有细胞或细胞组分的过程。通过细胞工程可以添加或增强特定的细胞功能。

按其内部特性划分，人工细胞可分为经典（typical）人工细胞和非经典（nontypical）人工细胞两大类。经典的人工细胞在结构上与天然细胞相似，并表现出活细胞的一些关键特征，如物质和能量代谢、自我生长、繁殖甚至进化。[4,5,10]非经典人工细胞是模拟了天然细胞的一种或多种特征的工程化材料，例如某些细胞功能、表面特征、形状、甚至形态；这种人工细胞没有结构方面的约束限制。[3]

根据构建方法划分，人工细胞分为自上向下的和自下向上的人工细胞（图2）。[11]自上而下的方法是利用生物学方法，去除活细胞中非必需的基因和细胞器，或者用合成的基因组完全替换原有的基因组，直到获得能够存活的最小单位。[12-14]自下而上的方法是从零开始构建细胞，即通过化学方法组装有机生物分子或无机材料，以构建出具有某些模拟细胞功能的微囊泡。[15]这两种方法有很大不同，但它们相辅相成。研究人员已经使用这些方法设计和制造了各种人工细胞，涵盖了从简单的原始细胞到复杂的工程化生物细胞。

图2. 通过自上而下和自下而上方法构建人工细胞。经参考许可转载 [3]. 版权所有 2016 Elsevier。

一、人工细胞的发展历程

1957年，科学家们成功地用构成细胞膜的脂质制造了囊泡。[16]这是人工细胞研究的里程碑。从那时起，单层或多层脂质囊泡经常被用于封装人工细胞成分。多层囊泡 （MLVs）最初被用于测试特定肽链对于脂质膜的动力学、功能或其他特性的影响。[17]也已成功制备单层囊泡并用于研究。单层囊泡分为巨型单层囊泡（GUVs，直径>1 μm）、大型单层囊泡（LUVs，直径100 nm-1 μm）和小型单层囊泡（SUVs，直径<100 nm）。这些囊泡被用于仿生从真核细胞到细胞器或细菌的各种生物形式。其中，GUVs表现出与天然细胞相似的大小和形态，因此最常用于制作人工细胞以研究细胞膜的性质（图3A）。

图3. 基于脂质、天然细胞和聚合物的人工细胞的图像。（A）在叉指电极表面形成的1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆（DOPC）GUV的荧光图像和放大视图。比例尺，100 μm。经参考许可转载 [55]. 版权所有 2012 皇家化学学会。（B） 由天然HeLa细胞膜生成的人工细胞的荧光图像，其膜由荧光素标记的单链DNA所包围。比例尺 10 μm。根据知识共享署名许可 [CC BY 4.0] ref [31]. 版权所有 2019 美国科学促进会。（C） 由聚合物 [尼龙] 材料膜组成的人工细胞的显微图像，其含有红细胞裂解物。经参考许可转载 [44]. 版权所有 1964 美国科学促进会。

上世纪60年代，磷脂被广泛用作组装GUVs的仿生材料。[18]磷脂材料具有高渗透性、高横向流动性和低生物毒性的特点。[19]由磷脂GUVs衍生的人工细胞具有很大的酶的包载量。Picon等人用脂质囊泡包埋cyprosin蛋白酶以制备人工细胞，并用脂质囊泡生产奶酪；这一策略加速了奶酪的形成并大大缩短了成熟时间。[20]

由纯磷脂组成的脂质囊泡只能仿生细胞形状，并将内容物与外界隔离。相比之下，天然细胞是由含有大量功能蛋白质的复杂细胞膜所围成，其中的蛋白质包括离子通道和转运蛋白等，它们介导了细胞与环境之间的物质和信息交换，以维持细胞内和细胞间的功能。为了使人工细胞更“逼真”（lifelike）并执行特定的细胞功能，故将膜蛋白添加到磷脂双层中，还可通过调节膜的脂质成分来调节这些蛋白质的活性。通过这种策略，研究人员可以探索特定细胞膜蛋白的功能和机制，研究营养物和废物的生物活性和功能，[21]细胞内信号转导，[22]细胞间相互作用，[23,24]以及遗传活动和演化机制。[25]1984 年，Chen 等人以大肠杆菌（E.coli）的乳糖载体、二油酰磷脂酰乙醇胺和二油酰磷脂酰胆碱为组件进行重构，探讨了大肠杆菌乳糖载体活性对氨基磷脂上氨基的需求。[26]2018年，Lee等人以三磷酸腺苷（ATP）合酶、两种脂质和光转换蛋白为组件，重组出了GUV膜，并将光合细胞器包裹在 GUVs 中，以形成一个细胞系统。该作者成功证明了可以光控两种ATP依赖型反应，即碳固定和肌动蛋白聚合。光控的肌动蛋白聚合反过来也改变了人工细胞囊泡的形态。[27]

值得注意的是，膜蛋白在囊泡中的嵌入有时会导致双层膜结构中脂质分子的重排，从而导致脂质膜的不稳定。天然细胞膜是一种由脂质、蛋白质和糖类组成的半透薄膜，[28]细胞膜的成分与细胞的功能密切相关。[29]因此，从天然细胞中提取含有天然蛋白质和小分子的膜制剂作为组装原料，已成为赋予囊泡类似天然细胞结构和功能的常用方法。1977年，Sandermann等人将α-D-半乳糖苷酶重组到由大肠杆菌纯化得到的脂质体中，在其中的蛋白质功能保持完整。[30]使用天然细胞膜构建人工细胞也可用于研究和鉴定特定膜蛋白的特征。2019年，Liu等人将HeLa细胞与羧化富勒烯纳米材料共培养，并用白光照射样品，以产生保留了细胞表面特性的人工细胞。这种人工细胞保留了HeLa细胞膜的膜特性和功能化外源核酸分子的能力。这一成就指导了将人工细胞作为递药系统的研究（图3B）。[31]

磷脂作为细胞膜系统的主要组分，是人工细胞研究的主要关注点。[32]脂肪酸是脂质家族的另一个重要成员，其成分比需要复杂合成过程的磷脂更简单。[33]因此，脂肪酸已成为研究细胞原始形态的重点。[34,35]脂肪酸是单链两亲分子，可以在水中形成双层、囊泡和胶束。1973年，Gebicki和Hicks报道了脂肪酸自组装成囊泡。[36]该作者证明油酸（一种不饱和脂肪酸）在弱碱性条件下会形成球体。研究人员推测这种囊泡可以用作原始细胞膜的模型，并发现这些囊泡可以生长分裂。Berclaz等人使用cryo-TEM观察含有铁蛋白的油酸囊泡的生长和分裂；这清楚地证明了脂肪酸囊泡的生长能力。[37]

脂质在人工细胞领域得到了广泛的研究。然而，脂质材料的低稳定性和苛刻的化学修饰条件，限制了它们在人工细胞中的进一步开发和更广泛应用。[38,39]近年来，越来越多的研究人员倾向于使用两亲嵌段共聚物作为脂质替代物来组装聚合物囊泡。[40]两亲共聚物和磷脂都具有与疏水端共价连接的亲水端。[41]嵌段共聚物也可用于构建巨型囊泡，称为巨型聚合物囊泡。[42]可通过调控总分子量 （MW）、MWs的分散性、嵌段的比例、化学、构造、溶剂相互作用以及给定溶剂中嵌段间的相互作用，来调节由嵌段共聚物形成的囊泡的性质。通过控制这些因素，可调控嵌段共聚物的特性，更好地服务于人工细胞的构建。[39]一般来说，聚合物的平均分子量大于脂质分子，聚合物膜比脂质膜厚，这导致聚合物膜和脂质体之间的弹性和粘度存在差异。较厚的聚合物囊泡膜有较低的渗漏和渗透性、较低的横向流动性、较高的稳定性和化学多功能性。[43]

1964年，Chang用尼龙半透膜包裹组织细胞，只允许小分子营养物、代谢物和分泌物通过，而阻止细胞和抗体等大分子物质通过（图3C）。[44]Chang随后表明，这种半透膜还可以包裹血红蛋白、酶、细胞、微生物、吸附剂、磁性材料和其他生物活性物质。[45−54]膜可保护人工细胞内的生物活性物质不与外界环境直接接触，并允许小分子进出，例如酶的底物、激素、短肽和小分子量蛋白质。因此，使用不同类型的膜材料可以控制膜的渗透性。

常见的聚合物包括天然高分子材料，如壳聚糖及其衍生物、葡甘露聚糖和纤维素，以及合成的有机高分子材料，如海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠（sodium alginate–polylysine–sodium alginate）和无机烷基化前体。在1980年代初期，Lim和Sun制造了一种海藻酸钠-聚赖氨酸-聚乙烯亚胺膜，用它包裹胰岛细胞，并植入患有糖尿病的实验鼠体内。实验鼠维持正常血糖3周，但聚乙烯亚胺引起了炎症。[56]1986 年，O'Shea等人使用海藻酸钠代替聚乙烯亚胺制备海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠膜。[57]该膜表现出良好的生物相容性，并被成功用于构建人工细胞。此外，还可在共聚物形成的囊泡膜上添加离子通道、酶等功能蛋白，赋予细胞多种天然功能。[58−60]研究人员甚至开发了一种双层聚合物膜 GUV，它具有低渗透性、机械韧性以及细胞相似体积等特点。[61]

由于脂质材料和聚合物材料各有优劣，研究人员便开发出了脂质/聚合物材料组成的混合囊泡，以在单个膜结构中融合两种组分的有利特性（即脂质的生物相容性和生物学功能，聚合物的低渗透性和化学多功能性）；这种囊泡被认为是先进的囊泡结构。[62]2012年，Chemin等人将具有低熔化转变温度的脂质和具有高熔化转变温度的聚（二甲基硅氧烷）-接枝-聚（环氧乙烷）（PBMS-g-PEO）共聚物组装成GUV结构。[63]囊泡膜的物理化学性质可通过改变膜中的脂质/聚合物混合比例来调整，进而可研究膜融合和膜分离等生物过程。[64]

蛋白质-聚合物纳米共轭膜也引起了研究人员的关注，因为蛋白质可以赋予聚合物膜良好的生物相容性、相应的生物功能和生物降解性。[3]1964年，Chang生产出一种掺有交联蛋白的尼龙囊泡膜；它是通过将酰氯丝网与蛋白质单独反应形成稳定的囊泡膜。2013年，Mann等人将蛋白质-聚合物纳米复合材料组装到人工细胞中，并表现出刺激响应的能力。[65]直到目前，在用脂质和/或聚合物构建的人工细胞方面已取得了很大进展（表1）。

表1. 人工细胞研究的里程碑

年份	作者	里程碑	参考文献
1957	T. M. S. Chang	人工细胞概念的提出；成功由构成细胞膜的脂质创制出囊泡。	[16]
1964	T. M. S. Chang	开发了含有酶和血红蛋白的聚合物人工细胞。	[44]
	T. M. S. Chang	研制了交联蛋白-尼龙人工细胞。	[44]
1965	T. M. S. Chang	开发了多腔室人工细胞。	[66]
1966	T. M. S. Chang	研制了含有蛋白质的二氧化硅人工细胞和微球。	[67]
	T. M. S. Chang	研制了含有磁性和其他材料的人工细胞。	[68]
1966–1969	T. M. S. Chang	研制了具有超薄半透膜和血液灌注吸附剂的人工细胞。	[51,67,69]
1971	T. M. S. Chang	应用了植入的含酶人工细胞以抑制淋巴肉瘤。	[53]
1972	A. M. Rosental et al.	研制了具有转运载体的交联蛋白-脂质膜人工细胞。	[70,71]
1973	J. M. Gebicki et al.	发现了脂肪酸自组装成人工细胞膜的能力。	[36]
1976	T. M. S. Chang	研制了含有蛋白质和激素的可生物降解的聚乳酸人工细胞。	[68]
1977	K. Altendorf et al.	重组了α-d-半乳糖苷酶和天然细胞中提取的囊泡。	[30]
1980	F. Lim et al.	研制了封装胰岛细胞的藻酸盐-聚赖氨酸-藻酸盐人工细胞，并将其植入糖尿病大鼠体内。	[56]
1984	C. C. Chen et al.	重组了大肠杆菌的乳糖载体和脂质人工细胞。	[26]
1986	G. M. O′Shea et al.	研制了具有良好生物相容性的海藻酸盐-聚赖氨酸-海藻酸盐人工细胞。	[57]
1994	W. P. Yu et al.	研制了可生物降解的聚合物人工红细胞。	[72−74]
2001	N. Berclaz et al.	演示了与蛋白质和铁蛋白结合的脂肪酸人工细胞的生长和分裂。	[37]
2010	D. G. Gibson et al.	创造了人工合成基因组细胞	[75]
2011	M. Li et al.	开发了无机胶体人工细胞。	[76]
	S. Koga et al.	开发了无膜凝聚层人工细胞。	[77]
2016	C. G. Palivan et al.	研制了双层聚合物人工细胞。	[61]
2018	K. Y. Lee et al.	实现了光合成ATP及ATP驱动的人工细胞形态变化。	[27]
	Z. Chen et al.	开发了仿生天然细胞的人工β细胞，它可响应高浓度的葡萄糖释放胰岛素。	[78]
2019	J. Liu et al.	研制了由含酶MOF组成的人工细胞。	[79]
2020	Q. Yang et al.	实现了不同人工细胞群落之间的交流。	[80]
	S. Liu et al.	实现了人工细胞与天然人细胞之间的同源化学交流。	[81]
2021	J. F. Pelletier et al.	实现了能够正常生长和分裂的人工细胞。	[82]
	Z. Xu et al.	实现了具有主动运输能力的人工细胞。	[83]
2022	J. Liu et al.	实现了人工细胞中高血糖状态的感知和响应性胰岛素合成、释放。	[84]
	B. Lim et al.	演示了如何使用重编程的人工细胞靶向灭杀癌症。	[85]

虽然由脂质和有机聚合物材料组成的人工细胞的研究已取得进展，但这些有机材料的一些缺点，包括物理稳定性（如热稳定性或机械强度）和膜通透性的调控困难，严重阻碍了这些人工细胞在实践中的应用。因此，研究人员探索了无机胶体作为膜材料来构建人工细胞（图4A）。[86]

图 4. 基于胶体、MOF和凝聚体的人工细胞图像。（A） 二氧化硅纳米粒子分散在油中，自组装成无机胶体人工细胞（光学显微图像）。比例尺，200 μm。经参考许可转载 [86]. 版权所有 2014 爱思唯尔。（B） 由含酶MOF组成的人工细胞（光学显微图像）。经参考许可改编 [79]. 版权所有 2019 Wiley-VCH。（C） 在阳离子肽和ATP溶液中制备的凝聚体人工细胞（光学显微图像）；液滴由阳离子亚甲基蓝染色。经参考许可转载 [77]. 版权所有 2011 自然出版集团。

胶体囊泡（Colloidosomes）主要是由胶体颗粒在水/油两相系统中自组装形成的。[76,87−94]胶体囊泡有一个封闭的连续膜，它由紧密堆积的单层颗粒组成，它们会进一步相互连接，胶体囊泡就会转移到水相中。[95]胶体囊泡的大小、渗透性和机械强度可以被精确调控，由于无机膜易于修饰，从而可以修饰胶体囊泡的功能。因此，无机胶体囊泡已成为构建人工细胞的重要选项。

2011年，Mann等人开发了一种无机原始细胞模型。[76]该人工细胞的膜由胶体囊泡组成，这种胶体含有疏水/亲水的二氧化硅纳米颗粒阵列，尺寸为 20-30 nm。在界面组装过程中，在生物过程中起作用的各种分子（包括蛋白质、核酸和金属离子）能嵌入这种二氧化硅胶体囊泡中。研究人员还发现，一些胶体囊泡可以模仿天然细胞的生长、繁殖和吞噬作用。[96−98]总之，这表明胶体囊泡代表了人工细胞仿生应用的一个有前景的方向。

2019年，Liang等人报道了，由酶固定的金属有机框架（MOFs）组成的人工细胞，它能模拟多种细胞功能，包括调控分子转运、细胞代谢、细胞间通讯和可编程降解，并且在各种化学反应和和物理条件（图4B）[79]下均表现出优异的稳定性。MOF是由有机配体和含金属簇或金属离子自组装形成的，它具有许多优异的特性，如高负载能力、多功能性、可定制的组成和结构以及可调节的孔径。[99−101]使用MOF开发的人工细胞在研究细胞生物学过程和疾病治疗方面具有巨大潜力。Zhang等人通过将葡萄糖氧化酶（GOx）和氯过氧化物酶（CPO）嵌入沸石咪唑酯框架材料（ZIF-8）中，然后把它封装在具有出色炎症靶向活性和酶级联反应能力的中性粒细胞膜中，便可产生次氯酸，从而构建了仿生中性粒细胞的人工细胞。[102]

天然细胞还包含许多无膜结构（例如微生物颗粒（microbial particles）、卡哈尔体和核仁），这些结构是由特定成分之间高亲和力驱动的液-液分离过程所形成的。[103,104]这种凝聚体结构通常由两个以上带相反电荷的聚电解质（多肽、多核苷酸、多糖）或多价小分子（如ATP和亚精胺）之间的静电吸引作用而形成。[77,105,106]具有相同电荷的聚电解质也可以通过阳离子-π相互作用形成聚集体。[107]2011年，Mann等人提出了，通过在水中混合单核苷酸和阳离子肽形成无膜原始细胞模型（图4C）。[77]这种凝聚体表现出动态性，如液泡成核、尺寸和形状变化、生长和融合，[108]它可能是人工细胞研究和应用的重要原型。

上述人工细胞是使用自下而上方法来构建的。相较之下，自上而下的人工细胞构建，侧重于通过减少或简化活细胞的基因组来构建“最简细胞”。[109]最简细胞是具有生存所需的最少数量基因的概念细胞。对最简细胞的研究可以帮助研究人员了解最基本的生物学活动和过程。1995年，文特尔（Venter）等人通过全基因组随机测序和组装，确定了生殖支原体基因组的完整核苷酸序列（580070 bp） 。该基因组是所有已知自由生存的生物中最小的基因组，它包括DNA复制、转录和翻译、DNA修复、细胞转运和能量代谢所需的必需基因。[110]研究人员通过敲低或敲除必需基因，来探索潜藏在细胞活力的背后机制，随后发现维持细胞存活只需要256-350个基因。[12,111−117]2004 年，Gil等人利用计算、比较分析和系统实验方法，选出了206个蛋白质编码基因，这些基因包含了细菌细胞在没有环境压力的情况下生存繁殖所需的所有遗传信息。[115]通过进一步的理论假设，Luisi等人删除了许多残留了部分非必要功能的基因，进而将基因数量减少到大约150个。[118]然而，仅这150个存活基因的最小细胞只能从其环境（如培养基）中获得生存所需的营养。因此，培养基条件必须根据人工细胞中所含的基因进行精确调整。可进一步敲除基因并重复实验，以验证哪些基因是必需的，哪些是非必需的，这个过程有效但繁琐。[3]

其他的研究使用了一种更先进、更具挑战性的方法，即通过使用合成基因替换生物细胞的原有基因，来自上而下构建人工细胞。2010年，文特尔等人从数字化的基因组序列信息开始，完成了丝状支原体基因组JCVI-syn1.0的设计、合成和组装。然后，该作者将基因组移植到山羊支原体细胞中，构建了含有合成DNA的山羊支原体细胞；它表现出了预期的表型特征并能不断复制。[75]2021年，同一研究所使用JCVI-syn3.0，成功合成出了能正常生长分裂的人工细胞（图5）。[82]这无疑是自上而下构建人工细胞的里程碑。

图5. 基于JCVI自上而下构建可自复制的人工细胞的开发过程。经参考许可转载 [82]. 版权所有 2021 爱思唯尔。

自上向下法合成的人工细胞具有广阔的应用前景。Lim等人对去除了染色体因而无法生长或复制的大肠杆菌进行重新编程，使其表面表达了癌胚抗原 （CEA） 抗体，并表明了它能够将阿司匹林和水杨酸盐转化为抗癌化合物儿茶酚。这种人工细胞可以对表达CEA的结直肠癌细胞起到抗癌作用，并消除患者体内细菌不受控制生长的风险。这一成就为癌症的靶向治疗提供了新颖的方法。[85]

表 1总结了人工细胞的里程碑。尽管人工细胞开发的自上而下策略取得了进展，但迄今为止，研究人员仅使用自上而下的方法来构建最简生物体，例如病毒和细菌。由于基因组的复杂性，人工真核细胞尚未被成功构建。基因组工程的低准确率和高成本也是亟待解决的关键问题。

二、人工细胞的研究现状

1. 人工细胞的构建

人工细胞的构建方法被分为自上而下和自下而上两种方法。自上而下的构建方法在前面的章节和许多研究中都有描述，[12,13,75,119,120]因此，本节将重点介绍自下而上的方法。自下而上的构建方法能够更简单、快速和大规模生产人工细胞。

1.1. 脂质/聚合物囊泡人工细胞

从脂质或聚合物材料构建GUVs的方法是相似的，且本质上都涉及两亲分子的自组装过程，同时也取决于材料的溶解度。[121]组装巨型囊泡的方法有四种：温和水化法、相转移法、电形成法和微流控法（图6）。后两种方法是前一种方法的改进。[122,123]一些巨型囊泡具有其他结构，例如由多层脂质或聚合物组成的 MLVs 和内部具有多个较小囊泡的多囊泡 (MVVs)，可以与GUVs 同时获得。[124,125]MVVs由SUV/LUV组成，并被作为细胞器封装到 GUVs 中，以形成区室结构，这种结构可通过相转移和微流控方法获得。

图6. GUV构建方法示意图。（A）温和水化法（gentle hydration method）。（B）电形成法。通过向水化的两亲性薄膜施加交流电来形成囊泡。（C）相转移法。油滴中的水被单层包覆，然后通过油-水界面转移到水相中，产生具有双层膜密闭结构的巨型囊泡。（D）微流控法。在微毛细管装置中形成稳定的水/油/水的乳液，萃取中间油相溶剂，形成巨型囊泡。经参考许可改编 [39]. 版权所有 2022 皇家化学学会。

1.1.1. 温和水化法

温和水化法是一种利用膜膨胀原理获得GUVs的方法。在1960年代，这种方法被用于制备脂质体。[126]流程是，将磷脂或两亲共聚物溶解在有机溶剂（通常是氯仿）中。把该溶剂置于惰性气体或氮气中蒸发，直到样品干燥，便在固体表面（如玻璃基底）上形成磷脂或共聚物膜。然后通过添加水溶液使两亲性膜水化，并从表面形成GUVs。若在玻璃表面添加一层薄薄的水凝胶，可促进巨型囊泡的产生。[127,128]温和水化法简单、高效、易操作，已广泛应用于脂质和聚合物人工细胞的构建。但是，这种方法构建的GUVs的尺寸是不均一的；其膜结构难以控制，会同时制备出单层囊泡和MLVs。而且，由于引入酶、DNA等因素，会阻碍囊泡膜的自发膨胀，该方法的制备效率和装载效率较低。此外，先前的研究表明，使用温和水化法很难获得由脂质/共聚物混合而成的囊泡。[39]

1.1.2. 电形成法

电形成法的工作原理与温和水化法相同。[129,130]流程是，以温和水合法将两亲性分子沉积在固体表面；在电形成法中，玻璃升级为氧化铟锡（ITO）涂层玻璃。通过向水合两亲薄膜施加交流电场可以提高GUV膜的膨胀效率。通过这种方法形成的GUV的典型直径约为5-200毫米。[131]该方法简单方便，便于囊泡固定。与温和水化法相比，电形成法可使GUVs的尺寸分布更均一，但也可能同时制出其他不同结构的囊泡，如MLVs和MVVs。电化法也有缺点；带电磷脂很难形成GUVs，因为它们的表面电荷会影响施加在电极上的电场，并且该方法只能在低离子浓度的生理条件下形成囊泡。为了解决这些问题，研究人员通过调节外加电场的频率和振幅来修改电形成过程。[132−134]

1.1.3. 相转移法

基于乳液系统构建GUVs是另一种制备GUV的方法。在分散的水溶液中，巨型囊泡是微米级的液滴，通过两亲层与外界隔开。可采用相转移法得到该结构；流程是，制备包覆有脂质或聚合物单分子层的油滴，然后将油滴通过油-水界面转移到水相，使界面的单分子层包裹油滴，产生具有封闭双分子层膜结构的巨型囊泡。离心和显微操作也可用于促进这一过程并提高相转移效率。[135]与水化法和电形成法不同，相转移法产生的GUV膜由两层不同材料组成，囊泡稳定性好，形状规整。此外，这种方法可以通过将特定组件包含在单层水/油滴中来确保它们完整装载。这对于带电组分或体积较大的组分（如大分子和纳米颗粒）非常有用，这与水化法相比是一个更大的优势。然而，相转移法的缺点是操作难度高，而且产生的囊泡大小往往不同。值得注意的是，一些研究人员通过相转移方法生成MVV，以研究人工细胞的区室化。[136]

1.1.4. 微流控法

为了提高巨囊泡的生产效率，以及精确控制囊泡的大小和形状，研究人员开发了一种基于相转移法的微流控法。流程是，在微毛细管装置中形成稳定的水/油/水乳液，然后通过蒸发来提取中间油相溶剂（如甲苯和氯仿的混合物）。在这个过程中，脂质或聚合物在微流体通道中被浓缩，并逐个组装成巨型囊泡。[137]随着微加工技术的进步，各种架构设计的微流控装置被创造出来，以制备不同类型的巨型囊泡。[138]Huck等人报道了一种表面活性剂辅助的微流控通路。它通过精确控制脂质体形成过程中水/油/水乳液体系界面能，制得了具有层状结构的巨型囊泡；它们可用作仿生细胞中结构和交流的模型。[139]

研究人员还开发了各种微流控方法，例如微喷和乳化，以形成具有脂质或聚合物膜结构的巨型囊泡。[140]Lee等人利用乳化液滴的不稳定性，基于乳化控制模块仿生了多段区室化的细胞器结构，制得了多壁含水的洋葱状巨型囊泡。这种方法为人工细胞的设计提供了一种独特方法。[141]

脂质LUVs的构建方法还有很多，包括乙醚注入法、表面活性剂法和拟相蒸发法。在乙醚注入法中，先将溶解磷脂的醚溶液注入水溶液中；然后减压、蒸发乙醚，产生LUVs。其中，醚的选择可以是乙醚、甲醚（具有较低沸点）或二氯氟甲烷。然而，该方法无法调控LUVs中磷脂的浓度和组成，以及溶剂类型。在表面活性剂法中，先MLVs或SUVs与胆酸钠或脱氧胆酸钠等表面活性剂混合，再通过透析除去表面活性剂，便得到LUVs。该方法制备的LUVs受磷脂的浓度、组成以及透析速度的影响。在逆相蒸发法中，先在磷脂的醚溶液中加水，经超声处理后得到油水乳液；再将部分乙醚蒸发掉，在充分振荡乳液后得到水/油/水的反相。最后，通过进一步减压和去除乙醚可制得LUVs。[32]

SUVs具有尺寸分布窄、结构均一、直径小（几十纳米）的特点。构建脂质SUVs的方法包括超声处理和挤出法。在超声处理中，对MLVs悬液进行超声处理，可在氮气保护和冷却措施下得到透明的SUVs。挤出法是制备SUVs最常用的方法，[124,142,143]适用于制备含酶的囊泡。流程是，将脂质薄膜在缓冲液中水化，得到出分散液，经5次冻融循环，再反复推挤穿过聚碳酸酯滤膜至少13次，以形成单分散的SUVs。

1.2. 无机胶体人工细胞

无机胶体囊泡主要由胶体颗粒在水/油两相系统中自组装形成。胶体人工细胞的制备过程包括，在含有胶体颗粒（如二氧化硅纳米颗粒）的不混溶液体中，乳化待封装材料的悬液，使胶体颗粒吸附在乳化液滴表面，并互锁在一起形成壳层，该壳层具有可精确控制的渗透性和弹性（或破裂应力）。最后，通过离心将形成的胶体囊泡转移到与内部相一样的连续相液体中。胶体囊泡上由颗粒间隙形成的孔隙提供了渗透性（图7A）。[87]例如，Dinsmore等人在含有聚苯乙烯颗粒的甲苯-辛醇混合物中，乳化了聚-L-赖氨酸的水溶液，然后聚-L-赖氨酸在界面处吸附到颗粒上。以聚电解质聚-L-赖氨酸互锁在一起而成的胶体囊泡，更易变形，在破裂前可以承受大约50%的应变。这种胶体囊泡具有可控的弹性和渗透性的刚性外壳，可用作人工细胞。[87]无机胶体囊泡提供了一种从各种液体中生产人工细胞的简单方法，其尺寸可以控制在亚微米到几毫米之间。[144,145]此外，因为在最后一步之前，其内部和外部液体完全保持分离，所以这种方法最大限度地减少了封装材料的损失。

图7. 示意图，胶体囊泡、凝聚体和MOF衍生的人工细胞构建方法。（A）无机胶体人工细胞自组装过程示意图。先通过离心将含水颗粒吸附到溶液表面，然后转移到溶液表面。经[87]许可改编. 版权所有 2002 美国科学促进会。（B） 凝聚体人工细胞的结构示意图。阴离子DNA和阳离子DEAE葡聚糖的混合物发生液-液相分离，并形成凝聚液滴；添加DPPC的乙醇溶液以封装凝聚体。经 [148]许可改编. 版权所有 2021 美国化学学会。（C） MOF人工细胞的结构图。MOF细胞器由Zn²⁺、MEIM和酶组成，并被MPN所封装，而该人工细胞又被水包油乳液给包裹起来。经 [79]许可转载. 版权所有 2019 Wiley-VCH。

1.3. MOF人工细胞

MOF人工细胞的合成，涉及通过原位矿化将生物分子封装进ZIF结构，以构建MOF细胞器，即将生物分子（如催化酶）与2-甲基咪唑（MEIM）和Zn²⁺溶液混合，快速结晶形成MOF颗粒。[146]之后，金属酚醛网络（MPN）被用作细胞膜材料并由油/水乳液包封。三价铁和单宁酸可在不同形状的固体材料模板表面自组装形成涂层，形成平面或三维结构的网络。在去除模板后，就可得到胶囊结构的复合物，以构建人工细胞（图7C）。[79]由于MPN特有的膜通透性，由MPN组成的人工细胞被赋予了吸收分子和排出废物的可能性；此外，MPN包裹的MOF细胞器的理化性质更加稳定，经紫外线和热处理后仍能保持生物活性。[84]

1.4. 凝聚体人工细胞

与GUVs一样，凝聚体涉及使用微流控来形成两种带相反电荷的聚电解质或小分子的混合物，[147]例如阴离子DNA和阳离子二乙氨基乙基葡聚糖（DEAE葡聚糖），在静电作用驱动下会以受控的方式发生液液相分离，形成凝聚体液滴。也可加入磷脂的乙醇溶液，同样在静电作用驱动下，磷脂分子会将凝聚液滴包裹起来，形成磷脂包被的巨型凝聚体囊泡（图7C）。[148]因此，凝聚体可以很容易地与其他材料结合形成混合囊泡。研究人员可以通过操纵组分之间的相互作用来控制凝聚体的形成，例如使用激酶/磷酸酶对来控制RNA/肽聚集体的形成和溶解。[149]Deng等人实现了脂质体中热响应凝聚体的可逆形成和溶解，以及相关DNA捕获和释放。[150]

2. 人工细胞的（功能、行为）特性

合成人工细胞对于研究生物学过程和基因具有重要意义。几十年来，研究人员一直在尝试组装生物分子或活性成分，以制造出具有类似于天然细胞生物活性的人工细胞，例如生长、新陈代谢或其他过程。这些人工细胞的特性是由它们的组成材料和内部结构决定的。研究的主要焦点是这些人工细胞是否具有与天然细胞相似的特性。

2.1. 能量生产

天然细胞会从其环境中吸收能量，并将这些能量用于生长、运动或繁殖。人工细胞研究是试图使构建出的人工细胞，能将化学能或光能以连续的方式转化为细胞的能源，能以ATP的形式为人工细胞提供能量，模拟出天然细胞的自给自足。在天然细胞中，ATP的产生方式基于，通过呼吸作用或光合作用的电子传递链，把来自营养物质或光的能量转化为跨越细胞膜的质子梯度。光驱动质子（泵细菌视紫红质）和ATP合成酶已被成功重组为小型单层囊泡，并合成出了ATP。[151,152]Otrin等人利用接枝共聚物膜，组装出一个化学驱动生成ATP的人工模块，并将接枝共聚物/脂质膜、重组的ATP合成酶和末端氧化酶混合（图8）。[153]Wendell等人模拟光合作用，通过在蛋白质液滴中包封可产生ATP的前体，来产生能量。[154]Fukuzumi等人模拟了光合作用，还合成了其他参与能量转换的小分子，例如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸盐（NADPH）和H2O2。[155]

图8. 示意图，由接枝共聚物膜和混合的接枝共聚物/脂质膜组成的人工细胞，其中含有重组的ATP合成酶和末端氧化酶，故有利用化学能驱动ATP产生的能力。经参考许可转载 [153]. 版权所有 2017 美国化学学会。

上述过程将化学能转化为ATP，但很少有研究实现真正的能量再生。[9]在天然细胞中，大分子通过分解代谢被回收，并用于再生产细胞的构建组件和富含能量的化合物，例如ATP。若人工细胞缺乏这种能量和物质回收机制的新陈代谢，则通常会随着营养物质的消耗或废物的积累而迅速终结。迄今为止，尚未开发出可以将底物（如葡萄糖）转化为化学能，并通过烟酰胺辅因子循环偶联再生ATP的合成系统。因此，自下而上合成系统的能源供应问题一直没有得到解决。从生物和化学组件为起点，设计并构建能量转换系统，仍是一项重大挑战。

2.2. 生长、形态变化和分裂

天然细胞的生长、形状变化和分裂能力，也是研究人员试图在人工细胞中仿生的特性和活动。人工细胞的生长，包括细胞内容物的增长和细胞膜的生长。[156]细胞内容物的扩增，涉及细胞中基因表达和蛋白质翻译，而细胞膜的生长是依靠脂质/共聚物材料组装到细胞膜上。研究人员使用了两种方法来扩充膜。在动态膜中，例如以脂肪酸为基础的膜，外部添加的膜成分会自发掺入到膜上，这个过程主要取决于膜上的渗透压和细胞外介质中的脂肪酸浓度。[25]Luisi等人的开创性工作，表明由脂肪酸组成的囊泡在脂肪酐的水解下可以自催化和自繁殖（图9A）。[157,158] Libchaber等人在微流体装置中捕获单个GUV，发现磷脂囊泡可以在脂肪酸存在的情况下生长，并分裂成几个较小的囊泡。[159]

图9. 囊泡生长和分裂示意图。（A） 通过将脂肪酸胶束引入囊泡的外部环境，来诱导脂肪酸囊泡生长。经参考许可改编 [164]. 版权所有 2021 美国化学学会。（B） 通过装载棕榈酰CoA（P-CoA）、甘油-3-磷酸酰基转移酶（G3P-AT）和甘油-3-磷酸（1P-G3P）， 在巨型囊泡中产生了小型囊泡。经参考许可转载 [160]. 版权所有 1996 爱思唯尔。（C）大分子通过与生长中的膜相互作用，控制人工细胞的分裂。经参考许可改编 [171]. 版权所有 2012 美国国家科学院。（D） FtsZ和FtsA完全收缩形成Z环，并使人工细胞分裂。经参考许可改编 [164]. 版权所有 2021 美国化学学会。

磷脂膜的动态性较弱，因此需要在膜上原位生产膜成分，以使膜分子有效地组装到膜上。Wick和Luisi证明了，封装在GUVs中的酶可以内源性地产生膜脂；该作者制备了含有棕榈酰辅酶A（CoA）和甘油-3-磷酸 （G3P）的GUVs，并将甘油-3-磷酸酰基转移酶注射到单个GUV中（图9B）。[160]Schmidli和Luisi将四种不同的酶包裹在脂质GUVs中，不断将酰基辅酶A和G3P转化为二酰基甘油磷脂酰胆碱，并直接插入囊泡的双分子层中；这创造性地表明，脂质囊泡可以合成自己的脂质，并形成和更新自身的脂质膜。[161]作为替代的非酶促方法，使用基本的脂质化学和化学催化剂从两亲性前体生成磷脂膜。[162,163]通过酶催化内源性形成膜脂的缺点是，不同个体的脂质体在脂质生产方面表现出很大的异质性，并且由于产生的磷脂量有限，而无法观察到可见的囊泡生长。[164]聚合物人工细胞通常更稳定或更惰性，因此目前不用于研究人工细胞的生长。

虽然以人工细胞模拟自然细胞的分裂过程还有很长的路要走，但许多研究已经报道了人工细胞分裂（裂殖或出芽）的基本方法。引起这些分裂的原因包括，外部机械剪切、[165]膜生长或相分离。[166−168]Deshpande等人证明了，可以通过微流控法将脂质体定位到尖锐的边缘上，来诱导脂质体分裂。[169]Dreher等人表明，操纵外部溶液渗透压可以触发GUVs相分离，引发裂变。[170]Vance的研究表明，在保持囊泡体积的同时，扩大膜表面积所造成的不稳定性，可以促进囊泡以低速率出芽。[167]其他研究表明，可以通过控制人工细胞膜与大分子的相互作用，来控制细胞分裂（图9C）。[166,171]例如，Stachowiak等人表明，高浓度重组网格蛋白连接的epsin1 N端同源（ENTH）结构域会导致脂质体分裂。[172]低密度蛋白质若结合这些细胞大小的脂质囊泡膜，也可诱导人工细胞膜的分裂。[173]然而，仍需进一步研究，如何精细调节这些相互作用，以产生可控的分裂。

细胞骨架在调节天然细胞膜的变形和分裂过程中起着重要作用。[174]细胞骨架使真核细胞能够抵抗变形，在细胞内运输物质，并在运动过程中改变细胞形状。[175]在哺乳动物细胞中，通过分泌和内吞途径产生的囊泡脂质膜，其分裂和融合依赖于严格而复杂的蛋白质调控过程。[176]以脂质囊泡包裹细胞骨架系统，这样合成出的人工细胞，能通过渗透原理改变细胞形状、调节细胞体积。[177,178]这种方法有望使人工细胞完成迁移和有丝分裂等复杂任务。已证明含有大肠杆菌FtsZ和Min蛋白的人工细胞可以实现受控的分裂。[179] 由FtsZ和 FtsA形成的Z环完全收缩，并使人工细胞分裂（图9D）。[180]Anitei等人报道了，可以利用基于蛋白质的曲率传感器，检测单个GUV。酶介导的膜脂成分转化可诱导肌动蛋白力驱动的膜形状变化，并最终导致GUVs的分裂。[181]此外，现已发现了其他会影响脂质GUVs形状的蛋白质，例如蛋白质复合物HAMLET可以重塑GUV脂质膜。[182]虽然分裂过程应该由人工细胞内蛋白质网络理想地控制，但目前还很难在人工细胞中重现蛋白质网络在控制分裂中的调节功能。

值得注意的是，2016年，J. Craig Venter Institute（JCVI）、美国国家标准技术研究院 （NIST）和麻省理工学院（MIT）的研究人员通过自上而下方法，成功合成了一个简单的人工活细胞。然而，人工细胞在生长和分裂过程中表现异常，产生出细胞的形状和大小完全不同。JCVI的合成生物学团队持续研究了近五年，确定了七个有助于调节细胞增殖和生长的基因。[82]研究人员随后通过系统地添加和删除基因，构建了数十个突变菌株，并观察了不同基因变化对细胞生长和分裂的影响。

2.3. 跨膜运输

活细胞的新陈代谢和生长需要细胞不断地从环境中获取氨基酸、核苷酸、糖类等物质。跨膜运输能力在这些物质的代谢、生长功能、细胞对外部环境的感知、细胞间通讯和细胞内复杂反应中起着关键作用。

大多数大分子化合物不容易穿透磷脂双分子层，这是在人工细胞中使用磷脂材料的缺点。相比之下，脂肪酸膜具有相对较高的渗透性，但在维持新陈代谢所需的离子梯度和代谢物梯度方面，脂肪酸不如磷脂。因此，同时含有脂肪酸和磷脂的囊泡膜适用于一些需要增加渗透性的应用。[183]Zhou等人最近发现，同时含有脂肪酸和磷脂的囊泡膜会选择性地保留钾并排除钠，并且可以在没有蛋白质泵的情况下为这些离子建立跨膜梯度。[184]该作者表明，只需调节囊泡膜的脂质含量，即可调节人工细胞膜的离子渗透性。然而，调节人工细胞膜渗透性的最佳策略是模仿天然细胞，构建ATP依赖型膜蛋白泵，以维持离子梯度，浓缩代谢物。Vance等人探索了一种在脂质囊泡中重组膜蛋白的方法。该作者表明，可以在脂质膜的从头合成过程中，重组几种不同的膜蛋白，包括G蛋白偶联受体，并且这些蛋白质能保持功能正常（图10A）。[185]其他非蛋白质试剂也可用于调节磷脂膜的渗透性。例如，合成的离子通道和孔可允许无机和有机溶质在疏水膜区域扩散，而合成的离子载体可以分隔离子，并促进它们在膜上的传输（图10B）。[186]Muraoka等人设计合成了多通道的离子通道，它能以各向异性的方式结合到脂质囊泡膜中；这些通道通过可逆配体结合关闭和打开。[187]Simmel及其同事证明，由DNA折纸插入脂质膜构成的纳米通道，表现出类似天然离子通道的导电性和门控功能（图10C）。[188]这些发现为重组跨膜蛋白以产生选择性渗透膜提供了各种方案，这种膜能响应外部信号，并建立和维持离子梯度。

图10. 用于跨膜转运的合成蛋白质、孔和通道示意图。（A）在非酶促磷脂膜的形成过程中，跨膜蛋白自发重构。方法是用合成的溶血磷脂酰胆碱类似物溶解蛋白质，溶血磷脂酰胆碱类似物作为洗涤剂可与蛋白质形成胶束溶解的蛋白质复合物，再添加活性烷基前体，随后其偶联反应导致蛋白质脂质体的自发形成。经 [185] 许可转载. 版权所有 2015 Wiley-VCH。（B）合成的生物孔模拟物，将其插入脂质膜可增加渗透性。经[186]许可转载. 版权所有 2011 英国皇家化学会。（C） 将DNA折纸插入膜上，形成特定直径孔洞的离子通道，圆柱体代表DNA双螺旋结构域，红色表示跨膜链段；带有橙色椭圆的橙色链表示胆固醇修饰的寡核苷酸与单链DNA适配体的杂交。经[188]许可改编. 版权所有 2012 美国科学促进会。

2.4. 环境响应、动力和趋化性

细胞为了在动态的生理环境中生存，必须不断地感知并响应环境变化。天然细胞能感知外部环境的各种参数的变化，例如pH值、温度、化合物浓度、离子浓度或特定配体的接触。Hest的小组通过向GUVs添加外部小分子触发器来可逆地控制蛋白质-配体相互作用。[189]该研究人员利用乙醇脱氢酶（ADH）在两种不同的小分子底物转化过程中，升高或降低内部pH，从而调控人工细胞膜上的Ni-NTA配体与囊泡空腔中寡聚组氨酸标记蛋白之间的pH敏感型相互作用，可通过它的拮抗剂代替原有基质来可逆地调控这个过程（图11A）。这种方法适用于控制任何组氨酸标记的生物分子与人工细胞膜的结合/解离。Peng等人在由天然细胞膜衍生的人工细胞上，组装了一个ATP驱动的DNA纳米门卫（nanogatekeeper），并将不同模块组成的信号网络封装在细胞中。[190]这种基于DNA的分子信号转导系统能响应环境中的ATP，在ATP存在的情况下，会打开纳米门卫并启动一系列下游反应。此外，细胞响应后，该人工细胞内的反馈通路会将纳米门卫切换回关闭状态。Liu等人报道了一种基于MOF的人工β细胞；封装的MOF细胞器能感知环境中的高血糖，启动可编程的胰岛素基因转录和蛋白质翻译，然后分泌胰岛素。[84]

图11. 人工细胞对环境激活的响应示意图。（A）可逆地控制人工细胞中蛋白质-配体相互作用的小分子触发器。小分子触发器ADH用于可逆地改变GUVs中的局部pH值，以调节Ni-NTA配体和组氨酸标记蛋白之间的pH敏感型相互作用。在酸性pH值下，相互作用会被阻断；若pH值增加，相互作用则增强。经[189]许可改编. 版权所有 2015 Wiley-VCH。（B）由热响应二嵌段共聚物制成的聚合物人工细胞；在热响应段的钌催化剂发生氧化还原变化后，其体积和形状实现自主振荡。经[60]许可转载. 版权所有 2014 Wiley-VCH。

天然细胞膜的结构可以通过对酰基链和极性头基的酶改造来动态修饰，以调节信号转导或结合。这些动态变化的紊乱会导致疾病。合成膜通常是静态的；脂质体通常是动力学稳定的，二酰基磷脂不易发生交换。Devaraj等人通过在脂质自组装形成的GUVs溶液中加入反应性前体，实现了尾链和头基的交换，重塑了GUVs的膜组成，诱导了脂质结构域的形成；这启发了通过引入脂质头基的静电相互作用招募蛋白质。这些发现表明，能通过可逆反应的化学选择性来实现合成膜中磷脂的非自发重塑。[191]

天然细胞不仅会响应环境来动态调节其膜结构，还会根据外部或内部的触发因素而动态地改变其形状。Tamate等人表明聚合物和共聚物人工细胞随着温度变化和内部振荡反应进行，会发生振荡形变。[60,96]聚合物人工细胞由合成的热响应二嵌段共聚物制成，在热响应段的钌催化剂发生氧化还原变化后，实现其体积和形状的自主振荡（图11B）。共聚物人工细胞由自振荡微凝胶组成。除了膨胀/收缩振荡外，人工细胞还表现出剧烈的形态振荡，并且可在较大的共轭物上观察到多个屈曲点，类似于天然细胞的变形行为。

人工细胞在外部或内部刺激下对膜通透性的调节也已实现。Mann等人利用pH响应型共聚物，把水分散的共聚物交联，并共价接枝到二氧化硅纳米颗粒上*，构建了能选择性释放和吸收小分子的人工细胞。可通过静电门控的自激活和调节人工细胞膜的通透性，以触发内部的酶促磷酸化反应。[192]

译注：此处疑原文有误，有所修改。原文为 covalently grafting pH-responsive copolymers onto water dispersion copolymers from silica nanoparticles；译者以为后半句应为：from water dispersion copolymers onto silica nanoparticles。

许多自然细胞，如细菌、白细胞和单细胞动物，都在不断运动，并在运动过程中遵循化学梯度的方向，这被称为趋化性。用作药物输送平台的人工细胞也应能迁移到特定的化学环境，可由磁力、电场、光或化学燃料驱动人工细胞。然而，迄今为止开发的合成人工细胞很少表现出定向运动的能力。

研究人员从微/纳米电机的构造和功能中获得了灵感。微/纳米电机最常用的推进机制包括外场（如磁场）和化学梯度（如葡萄糖浓度梯度）。磁场可以驱动基于超顺磁性Fe3O4纳米颗粒功能化的微型机器人，在精确控制的方向上移动。[193]GOx修饰的纳米机器人被证明能够感知肿瘤微环境中的葡萄糖浓度梯度，从而促使纳米机器人在肿瘤中聚集。[194]催化剂在H2O2环境中产生的气泡，能推进具有不对称结构的催化剂修饰的微/纳米机器人。[195]Hest等人基于聚合物囊泡的受控变形，开发了一系列名为口形细胞（stomatocytes）的碗形聚合物囊泡。封装在其空腔中的酶和其他物质被证明可催化葡萄糖和过氧化氢等燃料分子的分解，从而促进口细胞运动，并且口形细胞在燃料存在的情况下以定向方式移动。[196,197]因此，作者使用类似于在天然细胞中观察到的口形细胞创造了该趋化系统。这种口形细胞能沿着过氧化氢的浓度梯度移动，甚至移动至产生过氧化氢的中性粒细胞处。[198]该系统模拟白细胞对炎症部位的趋化作用，为人工细胞在医学上的应用提供了广阔的前景。

3. 人工细胞的应用

材料的特将性决定它们的应用，人工细胞亦然。人工细胞设计的重点是构建出由功能性人工细胞膜包裹的细胞，而这些细胞能产生能量以吸收、处理和消除外源物。进而，人工细胞作为智能响应型生物材料、个性化药物的靶向递送系统、功能受损细胞的替代物等，具有巨大的应用潜力。

3.1. 封装和反应的容器

人工细胞的特殊区室结构为多种复杂反应提供了有利的场所和研究平台。研究人员已经在人工细胞中实现了许多简单的级联反应和细胞通讯。[22,25,199−201]Li等人在由DPPC组成的MLVs中嵌入淀粉葡萄糖苷酶（AMG）。该作者发现，封装在囊泡中的AMG在水溶液中的稳定性远高于相同溶液中游离AMG的稳定性（图12A）。[202]封装酶能与体积和表面积较小的人工细胞脂质表面相互作用，这可解释为什么许多酶在GUVs中比在开放系统中更有效。[203,204]Peng等人使用由天然细胞衍生的膜构建了人工细胞，并设计了基于DNA的分子信号转导系统。[190]人工细胞膜上装有由ATP驱动的DNA纳米门卫，内部封装着由不同模块组成的信号网络。在ATP存在的情况下，纳米门卫会打开，并启动一系列下游反应（图12B）。

图12. 人工细胞作为封装和反应容器的示意图。（A） DPPC囊泡中AMC水解淀粉的示意图。根据参考知识共享 CC BY 许可复制 [202]. 版权所有 2007 Springer Nature。（B）基于DNA的分子信号转导系统。配备了ATP驱动型DNA纳米门卫的人工细胞膜，它封装了一个包含不同信号网络模块的细胞。根据参考知识共享 CC BY 许可复制 [190]. 版权所有 2020 Springer Nature。（C）多区室囊泡的级联反应。经[125]许可转载. 版权所有 2017 英国皇家化学会。

使用多区室巨型囊泡是在人工细胞中实现细胞内通讯和级联反应的常用方法。巨型囊泡中的封闭区室将反应物包裹起来，有助于促进化学物质的选择性和连续释放，从而引起级联反应和其他复杂的生化反应，区室之间的有效交流对此非常重要。Dittrich等人使用利用微流控方法操控酶级联反应，组装了多囊泡系统（图12C）。[125]这种系统有潜力进行时空分离的酶级联生物催化。Belluati等人将以囊泡或纳米粒子组成高分子人工细胞器，并将其装载到由聚合物组成的GUVs中，产生了更复杂的级联反应。[205]其中，囊泡内两种人工细胞器的相互刺激触发通讯，可以诱导酶促反应，并允许酶促底物从离子通道介导的纳米颗粒中释放出来。使用GUVs作为生物反应容器的一个障碍是脂质膜的半透性；非极性小分子的跨膜渗透性很高，而极性大分子的跨膜渗透性很低。这个问题解决方法之一是，使用聚合物修饰脂质来阻碍小分子自由穿过膜。[206]目前，使用组合方法进行囊泡工程化的成功实验越来越多，使用人工细胞来产生酶驱动的生物催化和其他复杂级联反应的方法也正处于不断改进之中。

基因和蛋白质的表达是人工细胞发挥功能的关键之一。脂质囊泡可以封装整个转录和翻译过程的复杂生化反应网络，囊泡的通透性允许囊泡内外环境之间进行选择性的物质交换。Libchaber等人在单个GUV中表达了增强的绿色荧光蛋白（eGFP），该GUV包含从大肠杆菌中提取的无细胞表达系统（图13A）。[21]为了在GUV中维持长时间的蛋白质表达，便在囊泡中合成α-溶血素蛋白，并使其重组到到脂质双层中，以增加囊泡膜的通透性，使营养物质能够从囊泡外渗透到 GUVs中。Danelon等人使用含有14个碳酰基链的短二聚磷脂构建了半透性GUV膜，并在GUV中一起封装了DNA和RNA模板、大肠杆菌核糖体和噬菌体T7 RNA聚合酶等蛋白质。[207]这种人工细胞能从环境中吸收核苷酸和氨基酸等要素，从而促进特定蛋白质的表达（图13B）。

图13. 能合成蛋白质、DNA和RNA的人工细胞图像。（A） 经过数小时后，在囊泡聚集体（左）、单个囊泡（中）和二联体（右）中，α-溶血素与eGFP融合。大肠杆菌提取物和 pIVEX2.3 d-α-溶血素-eGFP质粒（0.5 nm）被封装在处于营养物溶液环境的囊泡中。比例尺20 微米。经[21]许可转载. 版权所有 2004 美国国家科学院。（B） 荧光图像（左）和示意图（右），表达GFP蛋白的酶和基因被封装在GUV中。经[207]许可转载. 版权所有 2012 Wiley-VCH。（C） 在GUV中进行T7 RNA聚合酶催化的RNA合成。（a） DIC；（b–f）荧光模式。比例尺 50 微米。经[208]许可转载. 版权所有 2002 Wiley-VCH。（D） GUVs中的DNA扩增。方法是使用水化法制备含有PCR试剂的GUVs水分散液，缓冲溶液含有DNA模板、引物、荧光标记SYBR Green I、三磷酸脱氧核苷、DNA聚合酶和Mg2+。经[166]许可改编. 版权所有 2011 自然出版集团。

人工细胞中的基因表达需要在单个GUV中进行酶促DNA和RNA合成。Fischer等人将DNA模板和T7 RNA聚合酶引入到单个GUV中，并在外部溶液中加入三磷酸核苷酸底物和少量乙醇；底物扩散到GUV中，并实现了特定mRNA的合成（图 13 C）。[208]此外，Kurihara等人在GUV中成功通过聚合酶链反应（PCR）扩增DNA（图 13 D）。[166]此外，人工细胞可以实现复杂基因组的高效合成。Van Nies等人将来自Φ29病毒和线性DNA模板的DNA复制蛋白，封装进GUVs中进行DNA复制。[209]

3.2. 物质和信息交换的载体

人工细胞和天然细胞之间的物质交换依赖于膜融合。膜融合是许多生物过程中都涉及到的基本现象，例如细胞膜上的胞吞作用和胞吐作用，细胞器的融合、膜上脂质和蛋白质的交换[210]、病毒感染。[211,212]研究人员已广泛研究了用于脂质GUVs的膜融合机制。因为磷脂膜具有良好的流动性和渗透性，所以GUVs人工细胞可以模拟瞬时孔形成和受体招募等膜事件。[213,214]

囊泡的膜融合主要由寡核苷酸链的结合或与脂质相连的寡肽来驱动。典型的膜融合过程，例如运输神经递质的突触小泡与神经元质膜之间的膜融合，受可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感性融合蛋白受体（SNARE）复合体的控制。[215,216]Kros等人设计了一个类似于SNARE的系统，它依赖于连接到脂质膜上的两种寡肽（LPE 和 LPK）相互作用而产生的驱动力，形成LPE/LPK复合物，从而使两种脂质体紧密结合，引发脂质膜的融合（图14A）。[217]研究人员还使用一对DNA脂质共轭物代替脂质化寡肽，两段成对DNA序列可依靠互补寡核苷酸链的特异性结合，诱导囊泡与脂膜紧密接触，促成囊泡间的膜融合（图14B、C）。[218]研究人员发现，囊泡膜从接触到融合，经历了对接、半融合和全融合的过程。这种囊泡模型的膜融合研究有助于了解基本的膜融合过程，例如内吞作用和胞吐作用期间的膜事件。这些发现能应用于关于大分子物质的细胞间转运的领域。

图14. 作为物质交换载体的人工细胞图像。（A） 由LPE/LPK复合物驱动的脂质体膜融合。（a） 脂质化寡肽LPE和LP的空间填充模型，组成结构是DOPE尾部通过PEG12连接到螺旋寡肽E和K上。（b） 当携带LPE（1）的脂质体与携带LPK（2）的脂质体混合时，（通过E/K）形成线团，促成脂质体融合。经[217]许可转载. 版权所有 2009 Wiley-VCH。（B） 囊泡与脂质膜发生对接时的模型。脂质膜融合是由一对互补的膜锚定DNA诱导的。两个互补DNA的反向平行杂交促使囊泡和脂质膜维持紧密接触。经[218]许可转载. 版权所有 2009 美国国家科学院 （C） DNA 介导一对脂质囊泡融合的可能阶段。混合后，DNA杂交使囊泡对接在一起，然后发生半融合。两个囊泡合并，内容物混合，实现完全融合。经[218]许可转载. 版权所有 2009 美国国家科学院 （D） SEM图像，具有可控纳米通道的人工细胞。比例尺，2 微米。经[83]许可转载。版权所有 2021 Springer Nature。

对于一些人工细胞的磷脂膜，还能利用蛋白质或非蛋白质试剂来调节小分子物质的交换。例如，依赖ATP的膜相关蛋白泵可以维持离子梯度并浓缩代谢物。合成的离子通道和孔允许无机和有机溶质在膜的疏水区域扩散，合成的离子载体可以区隔离子，并促进它们在膜上的传输。

最近，Sacanna和Irvine使用合成材料创建了一种具有主动运输能力的细胞模拟物。[83]该作者使用人工聚合物制造了一个红细胞大小的球形膜；他们在膜上形成了一个纳米通道，并在纳米通道中添加了一种化学反应材料，能起到泵的作用（图14D）。在光激活后，这种材料会产生化学反应并形成真空，从而主动将膜外的物质吸入细胞。当化学反应逆转时，泵会将物质排出细胞内部。

天然细胞能通过主动通讯交换信息，以协调它们在多细胞和单细胞环境中的行为。人工细胞也可以通过与自然细胞的交流，来影响自然细胞的行为。Gardner等人报道了一种能够与天然细胞交流的人工细胞。[23]这种人工细胞能从原料中产生各种糖衍生物，包括甲醛和硼酸，这类似于海洋细菌哈维氏弧菌中的生物发光诱导物。因此，这种人工细胞可以向哈维氏弧菌发送信号，使其发出荧光。Lentini等人使用人工细胞将大肠杆菌无法感知的化合物转化为信号分子；这些信号分子因此触发了大肠杆菌的细胞响应。[24]最近，Liu等人报道了一种基因编码的人工神经网络β细胞，它能感知环境中的高血糖，并合成和分泌胰岛素，以促进哺乳动物细胞摄取葡萄糖。[84]Liu等人利用含有血红蛋白的红细胞膜碎片和含有GOx的预制多糖多核苷酸聚集体，合成了具有血液相容性高、血液循环时间长等优点的人工细胞。[81]在葡萄糖和羟基脲存在的情况下，这种人工细胞会持续产生一氧化氮（NO），向血管细胞发送信号，并诱导血管舒张。这些结果标志着，对于实现人工细胞与人类天然细胞的主动同源化学通讯，已迈出了重要的一步。

人工细胞间的信号转导和通讯也取得了很大进展。Mann等人实现了两个胶体人工细胞之间的单向信号转导。[219]原理是，充满GOx的胶体囊泡会产生过氧化氢，从而促使第二个胶体囊泡上形成壳，并且壳会表现出热响应。该壳改变了胶体囊泡的渗透性，并影响了人工细胞中的酶促反应速率（图15A）。Ces等人在两个相邻巨型囊泡之间的界面处形成双层膜，并插入跨膜蛋白α-溶血素（α-HL）。[220]该作者通过荧光渗漏的测量证明了囊泡界面膜（VIM）系统内的物质转移和囊泡间通讯，演示了两个人工细胞之间的成功通讯（图15B）。Yang等人基于巨型囊泡模型设计了人工信号转导系统，来模拟天然细胞之间的通讯。[80]的方法是，通过激活固定在囊泡上的合成跨膜通道，来控制外部离子的流入。在这个系统中，来自某一人工细胞群落（GMVb）的类膜蛋白激活物，刺激了另一个人工细胞群落（GMVa）上的受体，于是释放出ssDNA信使，激活合成跨膜通道，促进离子流入，从而触发了封装在GMVa中的信号响应通路（图15C）。

图15.  人工细胞作为信息交换载体示意图。（A） 充满GOx的胶体囊泡会产生过氧化氢，从而诱导第二个胶体囊泡的NIPAM壳聚合（生成PNIPAM）。PNIPAM胶体囊泡的渗透性具有热响应特性，且会影响内部反应的动力学。经[219]许可转载. 版权所有 2016 Wiley-VCH。（B） 由α-溶血素（α-HL）蛋白孔连接的囊泡界面膜（VIM）系统。Ca2+可通过未被通道阻滞剂覆盖的孔选择性地转移材料。根据[220]的 Creative Commons CC BY License 分发. 版权所有 2018 Springer Nature。（C） 基于GMV的人工信号转导系统的设计和构建。来自其中一个人工细胞群落（GMVb）的类膜蛋白激活物，可刺激另一个人工细胞群落（GMVa）上的受体，释放出ssDNA信使，导致合成跨膜通道的激活和离子的流入，从而触发封装在GMVa中的信号响应。经[80]许可转载. 版权所有 2021 美国化学学会。

人工细胞之间、以及人工细胞与天然细胞之间的通信和相互作用仍需要更多研究。目前所获得的研究成果，远不如天然细胞间复杂通讯的广泛。研究人工细胞之间的相互调节，可能会推动具有复杂胞内通讯的人工细胞群的发展。对人工细胞群落行为的研究，是自下而上合成活组织的一大步，进一步的探索至关重要。

3.3. 医疗的应用

人工细胞的封装、跨膜转运、环境感知和定向运动等能力，为人工细胞在各个领域的应用奠定了坚实的基础。研究人员在基因和蛋白质表达、胞内级联反应和细胞间通讯等人工细胞功能方面的成果，也支撑起了人工细胞在医学领域的应用。自1957年Chang提出人工细胞的概念以来，多年来一直是该领域的重要贡献者，尤其是在人工细胞的治疗应用方面，做出了重要贡献。

标准化的细胞疗法始于患者的需求和医生的提议；该疗法进一步涉及细胞供体来源的选择、细胞的采集、分离与处理、细胞制剂的质量控制、临床方案的制定、伦理委员会的批准、临床疗效的观察与结果分析、医疗费用、患者的参与和经验、亲友、临床疗效的口头交流。细胞治疗产品中细胞的来源、获取和操作应严格遵守伦理规范要求。确保符合伦理标准也会增加细胞治疗的操作难度和成本。

人工细胞，是由具有良好生物相容性的人造和天然材料构建的类天然细胞结构。这种人工细胞可以部分执行天然细胞的功能，在临床医学中具有潜在的应用价值。对于人工细胞的应用，那些用于制造人工细胞的天然材料（来源细胞）必须符合现有的医学伦理规范。但由于人工细胞所需的材料量大、范围广，故人工细胞实验的伦理要求应比天然细胞实验更简化，这凸显了人工细胞研究的重大意义。

3.3.1. 给药系统

可用于药物递送的人工细胞有很多种，例如生物可降解的聚合物人工细胞和脂质人工细胞。通过表面配体或磁性材料，也可赋予这种人工细胞进行定向运动的能力。1965年，Bangham使用洋葱状同心多区室脂质双层模型构建了人工细胞。[221]自从Gregoriadis使用脂质体作为药物递送系统起，[222]脂质膜人工细胞已被研究人员广泛用于药物递送。[223]这种策略现在代表了一种非常成功的药物递送方法。

利用可生物降解的高分子人工细胞实现多肽、蛋白质等大分子的药物递送是一个主要的研究重点。1976 年，Chang构建了可生物降解的人工细胞，其中含有酶、激素和其他由聚乳酸制备的生物制剂。[68]其中，聚乳酸在体内可生物降解为水和二氧化碳，并已获得美国食品和药物管理局（FDA）批准用于医疗植入。改变聚乳酸人工细胞的分子量和膜构型厚度，会表现出不同的胰岛素释放速率。2016年，Bowerman等人证明，载有多烯紫杉醇的聚乳酸人工细胞，其疗效好于单独对紫杉烷耐药的三阴性乳腺癌使用多烯紫杉醇。[224]为了使载药人工细胞靶向病灶，研究人员将抗体组装进人工细胞的聚合物或脂质膜中。1966年，Chang制备了含有生物材料和磁性材料的人工细胞。[67]外部磁场能引导这种人工细胞的运动，或将它们从混合系统中分离出来。此后，磁性人工细胞被广泛用于药物递送（图16A）。[225]

图16. 人工细胞作为药物递送系统的示意图。（A） 靶向肿瘤的磁性人工细胞。经[226]许可转载. 版权所有 2013 Walter de Gruyter and Company。（B） 红细胞膜载药人工细胞的结构和功能图。（a） 设计和构建由含有血红蛋白的红细胞膜和含有GOx的凝聚体组成的人工细胞。（b） 在葡萄糖和羟基脲存在下，人工细胞不断产生NO并诱导血管舒张。经[81]许可转载. 版权所有 2020 Springer Nature。（C） 肿瘤靶向人工细胞的合成，及其与PTT/PDT联合治疗肿瘤的效果。该人工细胞是由包裹原卟啉IX的癌细胞膜碎片合成的，其中原卟啉IX还包裹着金属离子单宁酸。在磁共振成像、光声成像和光热成像的指导下，人工细胞在肿瘤中靶向聚集。经[228]许可转载. 版权所有 2020 美国化学学会。

衍生自天然细胞膜的人工细胞具有优良的生物相容性，是合适的药物载体。Lv等开发了热敏外泌体-脂质体杂化的人工细胞，可在包封粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和多烯紫杉醇后，将其递送至导致转移性腹膜癌的大结节。[227]这种人工细胞还能与腹腔热灌注化疗（HIPEC）相结合，显著抑制了肿瘤发展。Liu等人基于含有血红蛋白的红细胞膜碎片和含有GOx的预制多糖多核苷酸聚集体合成人工细胞，其在葡萄糖和羟基脲存在下持续能产生NO并诱导血管舒张（图16B）。[81]这种人工细胞具有高血液相容性和较长的血液循环时间，代表了血管狭窄和阻塞相关疾病的潜在治疗策略。

Qiao等人用原卟啉IX（一种集治疗性铁和多种治疗机制于一体的有机-无机混合材料）包埋金属离子单宁酸，再用癌细胞膜碎片包裹它，制成靶向同源肿瘤组织的人工细胞。[228]这种人工细胞在808 nm激光照射下，能产生局部热量以杀死肿瘤细胞，并在660 nm激光照射下能产生有细胞毒性的活性氧（ROS）以诱导肿瘤死亡。癌细胞膜的封装避免了内部材料在低pH肿瘤微环境中的降解。这种人工细胞结合了光热疗法（PTT）和光动力疗法（PDT），表现出比单独使用PTT或PDT更好的肿瘤灭杀效率。该人工细胞还可作为T1加权磁共振成像、光声成像和光热成像的造影剂，指导肿瘤治疗。这种人工细胞能指导与PTT/PDT联合治疗的开发（图16C）。

3.3.2. 替代天然细胞的功能

研究人员正在开发具有天然细胞复杂功能的人工细胞，包括靶向组织和释放治疗因子。衍生自天然细胞膜的人工细胞也能表现出逃脱免疫系统攻击的能力。这表明在某些应用场景中使用人工细胞具有替代天然细胞的潜力。

自1964年Chang报道人工红细胞以来，[44]世界范围内开发血液替代品的研究不断增加。[229−235]人体红细胞具有三个主要功能：（1）将氧气从肺部输送到全身组织，（2）清除有害的氧自由基，以及（3）将体内组织中的CO2输送至肺部排出。人工红细胞也可以模仿天然红细胞来完成这些功能。由Biopure和Northfield开发的PolyHb已在多项临床试验中得到探索。[231,235]这种人工细胞是根据Chang提出的戊二醛交联血红蛋白的基本原理发展而来的。[54]人工红细胞经巴氏灭菌处理，并常温保存，巴氏灭菌后无需血型鉴定或交叉配血。PolyHb的大规模临床试验目前正在进行中，包括一项探索在救护车中使用人类PolyHb的试验。Chang等人进一步设计了人工细胞（PolyHb-SODCAT-CA），（图17A）[236]它具有红细胞的所有三种功能。这三种功能得到增强，是因为人工细胞增加了红细胞酶的浓度。[237]人工细胞冻干制剂可长期保存，常温下安全性好。[238]这些人工细胞在动物实验中，被证明在多项指标上明显优于全血，如降低细胞内pCO2、增加和恢复心电图的ST段、降低乳酸水平等。[239]

图17. 人工细胞作为天然细胞的替代物示意图。（A） PolyHb-SODCAT-CA的示意图；其浓度可达红细胞酶的六倍。根据[275]的 Creative Commons Attribution License [CC BY 4.0] 分发. 版权所有 2019 Informa UK Limited，作为 Taylor & Francis Group 进行交易。（B）人工β细胞的合成，其对高血糖环境的感知，胰岛素的合成和分泌，以及对哺乳动物细胞中葡萄糖摄取的诱导。经[84]许可转载. 版权所有 2022 Wiley-VCH。（C） 模拟中性粒细胞的人工细胞，其制造过程、生物反应过程、拟提出的机制和各种生物医学应用。经[102]许可转载. 版权所有 2019 Wiley-VCH。（D） 人工M2巨噬细胞，ChS在炎症区域的可控释放。经[243]许可转载. 版权所有 2021 爱思唯尔。

人工细胞还可以模仿血小板的凝血特性。在这类聚合物人工细胞中，细胞外层来源于天然血小板膜，可降低大鼠体内类巨噬细胞细胞的吞噬作用和免疫应答，结合到受损血管系统和血小板粘附病原体。[240]在爆炸创伤的啮齿动物模型中，静脉注射由肽嵌段共聚物组成的人工细胞可以控制出血并提高存活率。[241] Anselmo等人用聚合物构建出柔性、中空、圆盘状的人工细胞；[242]该表面模拟了配体介导的与血管性血友病因子和胶原蛋白的粘附，有效减少尾部截肢小鼠模型的出血时间。

Liu等人用两种具有不同功能的MOF细胞器来构成基因编码的人工β细胞，这些细胞器被MPN包裹。[84]这种人工细胞能感知环境中的高血糖，启动可编程的胰岛素基因转录和蛋白质翻译并分泌胰岛素。体外实验表明，这些人工细胞产生的β胰岛素成功地促进了哺乳动物细胞对葡萄糖的摄取。因此，这种人工细胞成功地模仿天然β细胞对身体的葡萄糖水平作出反应，并有望改善糖尿病治疗的临床结果（图 17 B）。

在肿瘤和炎症领域，人工细胞可能在某些方面超越天然细胞。Zhang等人将GOx和CPO嵌入到ZIF-8 中，并用中性粒细胞膜将其包裹起来。这种基于MOF的人工细胞能靶向炎症并产生次氯酸，因此它可用于靶向并消除恶性肿瘤细胞和病原体。[102]这种人工细胞产生活性次氯酸（HClO）的水平是天然中性粒细胞的七倍。这种具有模拟中性粒细胞特性的人工细胞在肿瘤治疗中显示出巨大的潜力（图17C）。

2021年，Ma等人将明胶和硫酸软骨素（ChS）组成炎症纳米凝胶，并包裹在巨噬细胞膜中，制备了人工M2巨噬细胞。[243]这种人工细胞在炎症急性发作期间实现了ChS的爆发释放，下调了炎症，并在低炎症活动期间持续释放ChS，以修复软骨。对小鼠的研究表明，这种人工细胞对骨关节炎（OA）的疗效优于M2巨噬细胞。此外，人工M2巨噬细胞能靶向炎症区域，并在该区域停留很长时间；这避免了暴露的ChS对巨噬细胞的免疫刺激。这一成果为进一步探索人工细胞携带药物的可控释放提供了基础（图17D）。

3.3.3. 酶和基因治疗

由于人工细胞的封装，人工细胞中的酶可以作用于渗透入细胞的底物，同时避免 了重复注射引起的过敏反应或抗体产生。[44,45,52,53]自1964年起，Chang的团队就一直在使用人工细胞进行酶疗法的研究。例如，在猫体内植入含有尿素酶的人工细胞，这会导致全身的尿素转化为氨。[70]将含有过氧化氢酶的人工细胞植入患有无过氧化氢酶血症的小鼠体内，替代了小鼠体内缺陷的过氧化氢酶，也避免了注射游离过氧化氢酶而引起的免疫应答，从而有效治疗这种先天性缺陷。[52,244]若将含有天冬酰胺酶的人工细胞植入患有淋巴肉瘤的小鼠体内，可延缓疾病发作和肿瘤生长。[53]Wetzler等人使用PEG-天冬酰胺酶治疗白血病患者，结果证明了人工细胞酶疗法的有效性。[245]Kaminsky等人将精氨酸酶包裹在从小鼠分离的红细胞中，构建了人工细胞；与未治疗组相比，这种人工细胞成功降低了精氨酸酶缺乏症小鼠血液的高精氨酸水平，并且人工细胞在体内长时间保持了酶活性。[246]含有PolyHb酪氨酸酶的可生物降解人工细胞可以进入黑色素瘤细胞，从而抑制皮肤癌的生长（图18A）。[247]Machover等人将L-甲硫氨酸裂解酶γ包裹在人红细胞膜中，构建了人工细胞。[248]这种人工细胞导致细胞外液中特定氨基酸的清除，并对许多人类癌细胞系产生细胞毒性，同时对正常细胞保持无毒。体外和体内实验表明，人工细胞能有效抑制肿瘤生长并保持长期酶活性。这些发现为癌细胞的酶疗法提供了强有力的支持。

图18. 用于酶和基因疗法的人工细胞示意图。（A） 含有PolyHb酪氨酸酶的人工细胞。这种人工细胞是由血红蛋白和酪氨酸酶与戊二醛交联，并用聚乳酸包裹而成。这种人工细胞可以通过将酪氨酸转化为左旋多巴，并局部降低酪氨酸水平，来改变肿瘤微环境。根据[247]的 Creative Commons Attribution License [CC BY 4.0] 分发. 版权所有 2016 希拉里斯。（B）外泌体-脂质体杂化的人工细胞，其中封装了CRISPR-Cas9质粒。经[260]许可改编. 版权所有 2021 英国皇家化学会。

使用口服代替注射，可以避免人工细胞在体内堆积。由Kjellstrand等人领导的一项临床试验证明了，与未处理组相比，口服含有脲酶和氨吸附剂的人工细胞可降低全身尿素水平。[249] Palmour等人的临床试验表明，与未治疗组相比，患有莱施-奈恩综合征的婴儿口服含有黄嘌呤氧化酶的人工细胞，可降低全身的毒性次黄嘌呤水平。[250] Bourget等人报道，苯丙酮尿症（PKU）大鼠口服含苯丙氨酸氨裂解酶的人工细胞后，全身苯丙氨酸水平下降，生长水平显着提高。[251] Sarkissian等人给PKU小鼠口服了聚乙二醇修饰的苯丙氨酸氨裂解酶人工细胞，与未治疗组相比，其血浆苯丙氨酸水平降低。[252] 最近，Abu Abed等人以聚（D,L-丙交酯-己内酯共聚物）为基础的高分子人工细胞包裹了溶菌酶和脱氧核糖核酸酶；[253] 该研究人员报道了，在模拟胃液和模拟肠液的情况下作为口服给药系统的高包封率。

使用人工细胞的酶疗法已在临床试验中广泛开展。含有天冬酰胺酶的人工细胞在III期临床试验中表现出可喜结果，其还可与化学疗法联合用于治疗癌症。含有胸苷磷酸化酶的人工细胞可用于治疗线粒体神经胃肠型脑肌病，目前正在进行II期临床试验。此外，含有酒精氧化酶的人工细胞正在进行酒精解毒治疗的临床前研究。[254−256]

人工细胞有能力封装DNA大分子，并将它们输送到其他天然细胞，这种能力使得人工细胞的基因治疗成为一种潜在策略。例如，由外泌体膜和脂质体融合形成的人工细胞可以封装和递送大DNA分子，包括CRISPR-Cas9表达质粒（图18B）。[257] Gee等人使用这种策略封装CRISPR-Cas9质粒，并将其递送进不能被脂质体单独转染的人骨髓间充质干细胞。[258] 在另一个例子中，Zhao等人利用癌细胞的膜包裹组蛋白和DNA，制造出模拟了癌细胞基因保护和转染功能的人工细胞。[259] 这种人工细胞表现出与癌细胞相似的免疫逃逸和同源靶向能力。这种人工细胞在体外和体内表现出高生物相容性和基因转染能力，是一种很有前途的癌症基因治疗工具。

3.3.4. 封装天然细胞

封装在人工细胞中的内分泌细胞可以避免被免疫系统清除，并保持有效的激素供应。[70]自1964年，Chang合成了一批含有完整天然细胞的人工细胞（图19），[44]这种人工细胞制备方法已在世界范围内被广泛开发用于细胞治疗。[45,56,246,261−264] 人工细胞，包括那些含有内分泌组织和含有基因工程细胞的人工细胞，有许多临床应用。一个重要的例子是，将胰岛包裹在人工细胞中以治疗糖尿病。动物实验表明，这种人工细胞具有良好的治疗效果，但一次性植入的起效时间太短，重复注射会出现滞留问题，对糖尿病等慢性病不实用。研究人员因此改进了生物材料的长期生物相容性和制备方法。[265]口服这种人工细胞也是一种很有前途的治疗方法。1996年，Prakash等人报道，与未治疗组相比，口服含有基因工程化大肠杆菌DH5细胞的人工细胞，可降低肾功能衰竭大鼠的血尿素水平。[266]研究人员对该方法的临床应用进行了广泛研究。[267] Liu等人使用含有骨髓干细胞的人工细胞进行大鼠肝脏再生；植入这种人工细胞的大鼠在90%肝切除后恢复率提高到100%。[47,268] 以特定组织或器官的形状，来制备可生物降解支架，也是一个有前途的方向。可把人工细胞植入支架中，并在支架中生长，直至达到所需的形状和大小。[269]

图 19. 人工细胞包裹天然细胞。根据[275]的 Creative Commons Attribution License [CC BY 4.0] 分发. 版权所有 2019 Informa UK Limited，作为 Taylor & Francis Group 进行交易。

3.3.5. 免疫疗法

肿瘤细胞的免疫疗法是目前医学研究的热点。免疫疗法对肿瘤具有很强的靶向杀伤力和低复发率，具有增强免疫系统和不直接损伤人体细胞的优点。然而，细胞免疫疗法需要克服政府监管、复杂的制造工艺和成本等障碍。人工细胞的潜在可再生性、鲁棒性和结构稳定性，促使研究人员探索它们在免疫疗法中的应用。[40]重要的是，可以把人工细胞设计成可逃避体内免疫细胞的抑制信号。这种人工细胞不消耗体内的氧气和营养，不分化成不同的表型，并且比未修饰的人工细胞表现出更长的循环时间。这种人工细胞可以通过表达天然细胞抗原肽，将自己伪装成体内细胞，减少吞噬和破坏。[270]例如，与没有模拟肽的人工细胞相比，全身注射与CD47模拟肽相结合的聚合物人工细胞，可减少巨噬细胞的摄取，实现更长的全身循环时间，并增强肿瘤靶向和标记。[271]又如，人工抗原呈递细胞（aAPC）由可生物降解的聚合物构成，其表面仿生了主要的组织相容性复合物分子和共刺激分子（如 CD28）；[272]它们与T细胞和抗原肽相互作用，模仿天然APC，采集病原体信号，并将它们与生物调节信号一起呈递给许多效应细胞。aAPCs已被证明可以在体外和体内扩增CD8阳性T细胞，并且能在黑色素瘤小鼠模型中指导免疫系统对抗特定的癌症抗原。

基于人工细胞的细胞免疫疗法研究正如火如荼。2019年，Song等人用聚乙二醇化的共聚物材料和CD47构建椭圆形aAPCs。[273]体外和体内实验表明，aAPCs可显著促进荷瘤小鼠体内特定CD8+ T细胞的增殖、局部浸润和肿瘤坏死，并最大限度地减少这些aAPCs的细胞摄取。2020年，Yang等人用氧化还原敏感性共聚物构建了aAPCs。[274]体内的抗原特异性CD8+ T细胞被载药聚合物纳米颗粒预激活，然后自动转变CD8+ T细胞的大小，并重新激活CD8+ T细胞。这种aAPCs表面负载有主要组织相容性复合物和CD28，并封装有白细胞介素2。当遇到具有高表面氧化还原电位的预激活CD8 + T 细胞时，aAPCs在肿瘤组织中变大。体内研究表明，基于此类人工细胞的免疫疗法具有令人印象深刻的抗肿瘤效果。

除了在上述领域的应用外，在农业、食品生产、水产养殖、化妆品、纳米实验室技术和纳米计算机技术等方面，人工细胞发展和应用也有很多报道。[275,276]

三、人工细胞的前景

人工细胞的概念于1957年提出，为研究人员探索细胞和生命的生物学过程背后的机制提供了新途径。开发和研究人工细胞的领域已取得了长足的进步。使用脂质和聚合物等材料，以自下而上策略构建人工细胞，已被证明可以仿生细胞的某些结构和功能，包括产生能量、生长、分裂、跨膜运输、环境感知和趋化性。这些能力赋予人工细胞广泛的应用和前景，包括作为包裹和复杂反应的容器、物质交换和信息交换的载体、以及多种治疗用途，例如药物递送、替代天然细胞、酶疗法和封装天然细胞。通过进一步优化，这些人工细胞可能会发挥一些活细胞的功能，在生命科学研究中发挥重要作用。在自上而下策略中，人工细胞产生方法为，逐个去除现有生物体的基因或全部替换原有基因。这个过程是繁琐的，但它也提供了一个关键的系统，来帮助我们更好地理解生物体的基本活动和过程。

目前，人工细胞的开发还处于初创阶段，研究进展仅限于开发具有区室化、生长分裂、信息处理和能量转换等功能的人工细胞。仍需要更多研究将天然细胞的复杂活动引入人工细胞，例如，通过使人工细胞更有效地与环境进行交流，构建更复杂的人工细胞网络，使具有不同功能的人工细胞协同工作，进一步提高复制、分裂、运动和进化等能力。[3]

若要实现上述改善人工细胞活性的目标，可能以下有几个方向：（1）应进一步开发替代材料，并通过整合多种材料的特性来构建多组分囊泡。例如，通过向膜结构中添加额外的蛋白质来组装囊泡，以确保膜的渗透性，并促进人工细胞与环境或相邻囊泡细胞之间的选择性物质交换。（2）人工细胞由刺激响应材料组装而成，能对特定的外界刺激作出反应。这种方法能够构建出可控调的微响应人工细胞系统。（3）制造具有复杂结构的人工细胞或人工细胞网络，例如构建具有多个区室的巨型囊泡。囊泡中的每个区室都可被视为能独立进行反应的人工细胞器；这些区室还要实现细胞内相互通信，甚至执行更复杂的代谢反应途径。[39]（4）算力和算法的进步为人工细胞的智能化研发带来了革命性的推动力。未来的人工细胞应该是一个能不断修正错误，随着时间推移而自我完善的细胞系统。干细胞技术、微流控技术、系统生物学和基因技术等生物技术领域的进步，将进一步推动人工细胞乃至超人工细胞（能进化出各种技能或表现出强适应性）的发展。

一些科学家认为，人工细胞的开发目标并不是执行活细胞的所有功能，而是利用膜环境，来组织反应物和催化化学反应。[164]例如，基于合成氨基酸序列的蛋白质从头设计，产生出不同的蛋白质折叠和功能，氨基酸在人工细胞中转化为各种蛋白质，赋予人工细胞各种功能。[277] 此外，通过控制单个细胞间、细胞与周围结构基质间，以及蛋白质间的简单相互作用，可以获得复杂且可控的组织形态。[278]

建立具有高等功能的人工细胞，将具有广泛的应用前景。高等人工细胞也将帮助研究人员探索生命活动背后的根本机制。人工细胞在生物医学领域的医疗应用已展露出重要价值，包括替换或补充有缺陷的细胞，以及药物递送。此外，人工细胞能够替代工程化生物体（例如细菌）来生产药物和燃料。也许，还存在许多其他未知的应用方法，有很大的想象空间；例如，制造一种类似叶绿体的人工细胞，它能依靠光合作用获取能量，并转化为人体可利用的能量，这既有趣又有意义。随着合成生物技术的不断进步，人工细胞工程将扩展到生物技术、医学和工业等诸多领域，并为改善人类福祉提供更多可能性。

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